妄学植物

凝胶的制备及电泳:

（1）玻璃板处理。事先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用去离子水冲洗，最后用95%乙醇擦拭、干燥。

处理小玻板：加1ml Repel-Silane（剥离硅烷）于小玻板未刻标记的一面，用特制纸巾将其均匀涂抹在整个表面。室温干燥5分钟，用纸巾沾95%乙醇擦去多余的Repel-Silane 2-3次。

处理大玻板：加8μl Bind-Silane（亲和硅烷）于1.5ml含8μl醋酸的95%乙醇中。充分混合使清澈透亮，全部加到大玻板未刻标记的一面，用特制抹布均匀涂抹整个表面。室温5分钟使挥干并用95%乙醇清洗3—4次洗去多余的Bind-Silane。

取0.4mm的边条，涂抹适当凡士林，置于左右两侧，将短板压于其上，用夹子固定住两侧，试一下鲨鱼齿是否可顺利插入；以1×TBE熬制1%琼脂糖凝胶，吸入玻璃板底部，冷却30min后用胶带密封，用夹子固定；将玻璃板近水平倾斜放置，准备灌胶。

（2）制备凝胶。 配置50mL 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶:加入40%丙烯酰胺7.5 mL、尿素21 g/32.5ml（加热溶解）、5× TBE 10 mL，搅拌均匀后加入10%过硫酸铵225μl，50μl TEMED ，混匀后立即用注射器抽取灌胶。

（3）灌胶。用注射器吸取上述溶液，排除针管内的空气，将注射器嘴插入两块玻璃板的空隙处，把溶液注如入其中，避免产生气泡。灌制后即将鲨鱼齿的平整侧插入凝胶液约0.5cm处，避免梳齿下产生气泡，用夹子夹住。让丙烯酰胺于室温下聚合1 h。聚合好的凝胶可在使用前贮放1~2 d，需用1× TBE浸湿的纸巾包住梳子及凝胶顶端，再用保鲜膜包好，贮于4℃。

（4）预电泳。胶聚合以后，将玻璃板安装在电泳仪上，当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔，电泳槽中加入足量的1× TBE 缓冲液。小心移去梳子，用蒸馏水清洗加样孔，50 W恒功率（I=60mA，U=2000V）预电泳30 min，以去除气泡。

（5）点样。把DNA样品与适量（8：3）凝胶加样缓冲液混合，95℃变性 5 min，立即置于冰上冷却待用，每个加样孔加5μL样品DNA。

（6）电泳。50 W（I=60mA，U=2000V）恒功率电泳，溴酚蓝至胶的四分之三处时，终止电泳。（此期间配制固定液）

银染检测：

（1） 固定（脱色）。在托盘1中加入1 L固定/终止液，将有胶的玻璃板放入托盘中，轻摇30min直到胶全部脱色；也可将胶在溶液中浸泡过夜（不摇动）。将溶液回收待用。

（2）洗胶。在托盘2中用1 L蒸馏水洗凝胶3次，每次3 min。在将玻板取出时，让玻板竖直滴干水10-20s。（此期间配制染色液）

（3）染色。在托盘3内加入1 L染色液，将胶板放入托盘中轻摇30 min。（此期间配制显色液）

（4）洗胶。将胶浸入托盘2中，快速摇晃数秒，拿出，滴干水，立即将胶置于配制好的显色液中。注意，从将胶置于水中到将其放入显色液中，时间不超过5~10 s。

（5）显影。轻摇显色液，直至胶上所有的条带都出现。

（6）定影（终止显色）。将回收的固定/终止液倒入显色液中，反应2~3 min。

（7）洗胶。将胶板用蒸馏水洗2次，每次2 min。

（8）干胶。室温下自然干燥。

条带观察和记录:把胶板拍照，也可干燥后永久保存。